生物技術(shù)已經(jīng)被各國視為一種高技術(shù)，在整個(gè)科學(xué)技術(shù)中占據(jù)了特殊的顯著地位，特別是生命科學(xué)的發(fā)展更 離不生物技術(shù)，生命科學(xué)的發(fā)展備受各國的重視。我國在很多大學(xué)中都設(shè)立了生命科學(xué)院?，F(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn) 為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切 關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程 中很多是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)， 雜交瘤單克隆抗體，*是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。正 在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)過程才能實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切 相關(guān)?？傊?xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量 又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的 應(yīng)用中牛血清又是為廣泛的，所以牛血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證牛血清質(zhì)量也是促進(jìn) 生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

一、 牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。  

1.提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物，以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。

2. 提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

4.是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。

5.起酸堿度緩沖液作用。

6.提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

二、 牛血清的主要成份

血清是一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常 隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。  

1.蛋白質(zhì)是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白，球蛋白。 纖維粘連素 細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞附著； α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促細(xì)胞附著；轉(zhuǎn)鐵蛋白 能結(jié)合鐵離子，減少其毒性 和被細(xì)胞利用。  

2.多肽：血小板促生長(zhǎng)因子能促細(xì)胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細(xì)胞增殖因子；成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，血清中含量雖很少，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有一定作用。  

3.激素：激素對(duì)細(xì)胞的作用是多方面的。

胰島素：促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細(xì)胞分裂有關(guān)。

類胰島素生長(zhǎng)因子：能與細(xì)胞表達(dá)的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用。

促生長(zhǎng)激素：促細(xì)胞增殖效應(yīng)。

Hydrocortisone：血清中含有定量的該成分，它可能兼有促細(xì)胞貼附和增殖作用，但有人證明，血清中的Hydrocortisone ，如細(xì)胞密度高時(shí)可能有抑制細(xì)胞的作用和誘導(dǎo)其發(fā)生分化。  

4其他成份

氨基酸、葡萄糖、酮酸等對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大。與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有意 義。

三、 牛血清的質(zhì)量要求

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的不斷提高對(duì)生物醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來越高，所以對(duì)制備工藝中所涉及到 的各種原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求也越來越高，特別是對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份――牛血清的質(zhì)量要求也 不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。  

（一）、WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：  

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。

3. 證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5. 無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染。

6. 對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我國在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包 括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。  

（三）、美國對(duì)牛血清的質(zhì)量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應(yīng)商的牛血清都已進(jìn)入到我國市場(chǎng)，他們對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求都極為嚴(yán)格，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。  

1） 血清來源：可從各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國農(nóng)業(yè)部進(jìn)口要求。地方當(dāng)局還不 清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質(zhì)量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗(yàn) 結(jié)果和交付情況。

2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10個(gè)月內(nèi)）血清靜脈取血。血清采集條 件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅 活。

3）血清的制備：

a. 超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量減到低，一般IgG≤5ug/ml，生物學(xué)活性不變。  

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧 化酶／過氧化酶方法測(cè)定）。  

c. γ－射線照射：已經(jīng)證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30～45KG。 而且這個(gè)劑量的γ－射線照射不會(huì)改變血清的理化性質(zhì)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。

4）除菌過濾:經(jīng)過上述處理的粗制血清再經(jīng)過一系列除菌濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要 通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜。

4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量

1）化學(xué)檢定：滲透壓 pH 蛋白含量――電泳法 白蛋白 球蛋白 血紅蛋白 隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應(yīng)增加，總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。

2） 微生物學(xué)檢查：細(xì)菌、真菌符合USP標(biāo)準(zhǔn)。

支原體：在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4周，培養(yǎng)溫度36℃±2℃ 分別在需氧和厭氧條件下進(jìn)行，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法 無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。  

病毒檢查：

牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue

牛腺病毒 Bovine Adenovirus

牛細(xì)小病毒 Bovine Parvovirus

牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus

狂犬病病毒 Rabies

呼腸弧病毒 Reovirus

牛呼吸道合胞病毒 BRSV

副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

檢查方法：

已證明無外源因子污染的牛細(xì)胞培養(yǎng)物，在細(xì)胞生長(zhǎng)液中加15％待測(cè)血清，連傳3代共21天。陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液 中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗(yàn)組同條件下進(jìn)行。在觀察期內(nèi)注意細(xì)胞形態(tài)變化或細(xì)胞病變。在觀察 期內(nèi)第14天待檢樣品和對(duì)照樣品用標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)方法檢查。  如待檢細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個(gè)含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對(duì)照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細(xì) 小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽性對(duì)照，再培養(yǎng)7天，用熒光 抗體技術(shù)進(jìn)行檢查。  細(xì)胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進(jìn)行觀察。取另外一個(gè)待檢細(xì)胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細(xì)胞、 豚鼠紅細(xì)胞和新鮮雞紅細(xì)胞作血球吸附病毒檢查。試驗(yàn)在2～8℃和20～24℃進(jìn)行。陰性對(duì)照細(xì)胞預(yù)先感染副流感 Ⅲ型病毒作為陽性對(duì)照。未感染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

3）內(nèi)毒素檢測(cè)

用鱟試劑檢查。  

4）細(xì)菌噬菌體檢查

主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。

5）激素含量測(cè)定

每批FBS對(duì)某些激素含量都要進(jìn)行測(cè)定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。

6）血紅蛋白檢測(cè)

血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％，血紅蛋白含量≤mg15/dl。

7）細(xì)胞生長(zhǎng)效果測(cè)定

a.細(xì)胞克隆效果測(cè)定

細(xì)胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653

血清濃度與細(xì)胞數(shù):

10％血清／1個(gè)細(xì)胞／孔

4％血清／5個(gè)細(xì)胞／孔

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI－1640， 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養(yǎng)10～

15天。試驗(yàn)中選擇一個(gè)已知參考牛血清作對(duì)照。

克隆效率計(jì)算：

克隆效率＝(陽性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100％  

相對(duì)克隆效率＝待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率

b.貼壁效率試驗(yàn)：

用人的傳代細(xì)胞作每批血清的貼壁效率試驗(yàn)，A549（人肺癌細(xì)胞）該細(xì)胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采 用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細(xì)胞接種數(shù)即10％血清――100細(xì)胞／孔，4％血清200介細(xì)胞／孔 。放36℃±2℃，濕潤(rùn)5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天，計(jì)算著色細(xì)胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清 濃度來確立實(shí)驗(yàn)血清支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的水平，分析兩種試驗(yàn)條件下平均貼壁效率。  

貼壁效率（％）＝(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)) X100％

相對(duì)貼壁效率＝被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效率

c. 二倍體纖維細(xì)胞促生長(zhǎng)試驗(yàn)

人二倍體細(xì)胞株   WI28   MRc5

25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，5％血清，每瓶接種1.5X105細(xì)胞連傳3代，每代血清濃度和接種細(xì)胞數(shù)相同，每代培養(yǎng)7天，每 代接種二個(gè)細(xì)胞瓶，36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進(jìn)行平行培養(yǎng)。每代收獲細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每批待 檢血清與參考血清的相對(duì)生長(zhǎng)率（RGR）。

RGR＝(試驗(yàn)血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)) X100％

牛血清主要質(zhì)量要求（Sigma）  

胎牛血清 新生牛血清 成牛血清  

牛齡 胎 10～14天 ＜10個(gè)月  

無菌 － － －  

病毒 － － －  

支原體 － － －  

噬菌體 － － －  

內(nèi)毒素（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)  

血紅蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5  

pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0  

滲透壓（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340  

新的藥品管理法即將公布，新的藥品管理法對(duì)生物制品提出更嚴(yán)格的質(zhì)量要求。特別是我國即將加入WTO，會(huì)有更 多的國外生物制品進(jìn)入中國市場(chǎng)，我國的生物制品也希望更多地走向市場(chǎng)，所以在制品質(zhì)量上要求會(huì)更高， 產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)應(yīng)主要靠質(zhì)量競(jìng)爭(zhēng)。所以對(duì)產(chǎn)品中的主要原材料的質(zhì)量要求也會(huì)越來越嚴(yán)格。如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物我國SDA 已提出嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并提出全國各使用部門達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的期限。為了貫徹2000年版《中國生物制品規(guī)程》標(biāo)委 會(huì)修訂了《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》其中包括了生產(chǎn)用牛血清的質(zhì)控要求，這是一個(gè)低要求，和國 外產(chǎn)品的要求還有差距，希望各牛血清生產(chǎn)單位和使用單位，自己能制定出更高更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，以進(jìn)一步提高我國生物制品質(zhì)量。